亞氨基二乙酸-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

IDA NUPharose HP 是含亞氨基二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）基團(tuán)的金屬螯合填料，適用于大部分帶組-氨酸標(biāo)簽（His-tag）蛋白的親和層析。，HP為High Performance的縮寫(xiě)，意為高分辨，微球的平均粒徑為~35μm。IDANUPharose HP未螯合金屬離子，用戶可螯合Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+ 等金屬離子后使用。

通過(guò)獨(dú)-特的配基修飾工藝，這款產(chǎn)品做到了親和力和特異性的平衡：對(duì)大部分帶組-氨酸標(biāo)簽蛋白的結(jié)合量大于50 mg/mL的同時(shí)，一步純化后樣品純度可達(dá)90%以上。

2 、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿，大腸桿菌表達(dá)帶組-氨酸標(biāo)簽的重組金黃色-葡萄球菌蛋白A，6 min 停留時(shí)間；c 10 cm 柱高下的最大測(cè)試流速；d 未螯合金屬離子狀態(tài)下的pH 穩(wěn)定性。

 3 、金屬螯合親和層析——IDA

金屬螯合親和層析是基于蛋白質(zhì)分子表面的組氨-酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等金屬離子形成穩(wěn)定的配位結(jié)合而進(jìn)行生物大分子分離純化的過(guò)程。其中，以Ni2+為螯合離子來(lái)純化6個(gè)或更多組-氨酸組成的Hig-tag標(biāo)簽蛋白最為常見(jiàn)，本說(shuō)明書(shū)也以該體系為例簡(jiǎn)要闡述IDA NUPharose HP的親和原理（圖 1）。

NUPharose基球修飾上IDA配基后，該配體擁有三個(gè)配位基團(tuán)，其中一個(gè)氮原子和兩個(gè)氧原子可以與Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位數(shù)的八面體結(jié)構(gòu)，剩余的三個(gè)自由配位點(diǎn)可以與溶劑分子或蛋白質(zhì)分子結(jié)合。Ni2+與組-氨酸標(biāo)簽蛋白的組-氨酸殘基的咪唑基團(tuán)配位結(jié)合的過(guò)程即為金屬螯合填料與目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合過(guò)程。提高緩沖液中咪唑的濃度可以將目標(biāo)蛋白洗脫，洗脫過(guò)程中咪唑和目標(biāo)蛋白競(jìng)爭(zhēng)與Ni2+的結(jié)合。降低pH會(huì)影響金屬離子與配體的結(jié)合，因此改變pH也是金屬螯合層析洗脫過(guò)程的方式之一，但pH不宜低于4，pH過(guò)低會(huì)將剝離金屬離子。通常也用pH4的醋酸鈉緩沖液清洗螯合Ni2+后的填料，以除去未穩(wěn)定螯合的Ni2+。

金屬離子親和層析過(guò)程的非特異性吸附可能來(lái)自離子相互作用、金屬離子與含組-氨酸、半胱-氨酸、色-氨酸的雜蛋白之間的相互作用。前者通過(guò)提高緩沖液的離子強(qiáng)度得到抑制，通常添加500mM的NaCl；后者可在上樣緩沖液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在沖洗過(guò)程中添加咪唑而除去。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可以得到樣品純度和收率均較高的結(jié)果。Ni-IDA NUPharose HP填料在使用過(guò)程中Ni2+脫落量少，可連續(xù)使用多次。當(dāng)填料性能明顯下降后可以用EDTA將原金屬離子剝離，重新螯合鎳后再生使用。不同金屬離子對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力與特異性不同，Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的親和力依次降低（影響產(chǎn)率），特異性依次升高（影響純度），可根據(jù)分離需求選定合適的金屬離子。對(duì)于大多帶Hig-tag標(biāo)簽的重組蛋白，Ni2+通常是首先考慮的金屬離子，建議使用螯合Ni2+的Ni-IDANUPharose HP。對(duì)于含組-氨酸、半胱-氨酸或色-氨酸的非標(biāo)簽蛋白，Cu2+的高親和力有利于結(jié)合目標(biāo)蛋白。對(duì)于磷蛋白，可考慮使用四價(jià)或者三價(jià)離子。值得注意的是，上述規(guī)律不總是成立，需根據(jù)目標(biāo)蛋白篩選合適的金屬離子。

4 、使用方法參考

 4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。IDANUPharose HP 的壓縮比為~1.20。為使達(dá)到裝柱比，可通過(guò)柱頭下壓的方法，也可以通過(guò)高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器）， 為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后， 用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來(lái)評(píng)價(jià)。

4.3  螯合金屬離子

IDA NUPharose HP 以未螯合金屬離子的形式出售，用戶可以在裝柱完成后再層析柱中螯合金屬離子，螯合過(guò)程參照以下步驟。

（1）配制50~200 mM的金屬離子溶液，例如螯合Ni2+通常用NiSO4。螯合Ni2+、 Cu2+、Co2+、Zn2+等不同離子的過(guò)程基本相同，需注意控制不同pH條件下不同金屬離子的溶解性，pH過(guò)高可導(dǎo)致沉淀。螯合Zn2+時(shí)，需控制pH=5.5或者更低；螯合Fe3+時(shí)，需控制pH=3.0左右。

（2）用純水清洗色譜柱，純水用量 3~5 CV（柱體積），流速100~200cm/h。

（3）用0.2~0.8 CV 的金屬離子溶液通過(guò)色譜柱，流速50~100 cm/h金屬離子過(guò)量50%時(shí)足夠螯合完-全。例如 IDANUPharose HP可螯合18 μmol Ni2+/mL，用0.6 CV的50mM NiSO4溶液螯合時(shí)，Ni2+過(guò)量67%。螯合完-全后色譜柱底部的顏色從白色變?yōu)轵咸囟ń饘匐x子的顏色。

（4）用純水清洗色譜柱除去過(guò)量的金屬離子，純水用量至少5CV，流速100~200cm/h。

（5）用20mM醋酸鈉+0.5M NaCl（pH=4.0）緩沖液將螯合不穩(wěn)定的金屬離子除去，緩沖液用量至少5 CV，流速100~200 cm/h。

（6）可直接用結(jié)合緩沖液平衡色譜柱。

在裝柱前螯合金屬離子的過(guò)程與上述在色譜柱中螯合一致，可在旋勻儀、反應(yīng)瓶（釜）中螯合金屬離子，利用過(guò)濾器清洗螯合前后的填料。

4.4 平衡與上樣（Equilibration & Loading）

金屬螯合填料與磷酸鹽、Tris-HCl等緩沖體系兼容，其中“20mM PB+500mM NaCl（pH=7.4）"的緩沖體系最為常用。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A。緩沖液A的特點(diǎn)為不含或者含少量咪唑，pH在7~8之間居多，呈弱堿性。實(shí)際使用過(guò)程中，如果上樣料液的體積特別大，從降低成本的角度考慮，可不往料液中添加咪唑和NaCl來(lái)抑制非特異性吸附，而是在上樣后進(jìn)行沖洗來(lái)去除雜質(zhì)。

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過(guò)程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo)、pH等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn)。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL 填料"來(lái)設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%，例如Ni-IDANUPharose HP產(chǎn)品對(duì)重組金黃色-葡萄球菌蛋白A（r-SPA，NRPA04）的DBC10%為~50mg/mL，純化 r-SPA 時(shí)的上樣量可為25~4mg/mL。除了DBC10%，也可以測(cè)試上樣流穿液中的目標(biāo)蛋白確定上樣量。上樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行離心（10000g 以 上）或/和過(guò)濾（0.22或0.45μm）等澄清處理，以免堵塞色譜柱。樣品的pH和鹽濃度可用緩沖液A或濃度更高的母液調(diào)節(jié)。

上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液A再平衡層析柱

4.5  洗雜（Wash）

在緩沖液A中添加5~40mM的咪唑沖洗層析柱，可以將非特異性結(jié)合的雜蛋白除去。咪唑濃度越高，雜蛋白被除去得越徹-底，但會(huì)降低目標(biāo)蛋白的收率。洗雜過(guò)程咪唑的濃度與不同蛋白的特性相關(guān)，可通過(guò)階躍洗雜過(guò)程（例如5mM、10mM、20 mM……）快速優(yōu)化洗雜條件。洗雜的體積通常為3~10個(gè)柱體積。

4.6 洗脫（Elution）

最-常用的洗脫方式為提高洗脫液中咪唑的濃度（在緩沖液A中加入咪唑），推薦在0~500mM范圍內(nèi)進(jìn)行階躍洗脫或者線性梯度洗脫。對(duì)于大多數(shù)帶組-氨酸標(biāo)簽的蛋白，200mM的咪唑濃度可以將目標(biāo)蛋白洗脫完-全。對(duì)于一些場(chǎng)合，也可以改變pH，結(jié)合較弱的蛋白可在pH6時(shí)可洗脫，結(jié)合較強(qiáng)的蛋白可在pH6~4時(shí)洗脫，需注意pH不能低于4。

4.7 再生（Regeneration）

在多次使用后，需要對(duì)填料進(jìn)行再生。可以選擇0.5~1柱體積200mM EDTA+500 mM NaCl（pH=7）的緩沖液將金屬離子剝離。再用50~200mM的金屬鹽溶液與IDA配基螯合，用純水將過(guò)量的金屬離子除去，用20 mM醋酸鈉+0.5 M NaCl（pH=4.0）緩沖液將螯合不穩(wěn)定的金屬離子除去。金屬離子的重新螯合參照4.3小節(jié)。

4.8  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過(guò)程可將填料徹-底清洗。若發(fā)生柱壓升高，或?yàn)榱吮苊饨徊嫖廴?，將金屬離子剝離后可進(jìn)行在位清洗過(guò)程?？刹捎靡韵氯軇┻M(jìn)行在位清洗：2mol/L NaCl ，1mol/L NaOH、70%乙醇或 30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑。

4.9 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~30 ℃為宜，不可凍存。