PRODUCT CLASSIFICATION
產品分類在基因組測序中,PCR擴增似乎是繞不過去的一步。然而,PCR也帶來一些問題,包括不均勻擴增,導致某些序列的比例過高。對目前的新一代測序(NGS)平臺而言,測序某些堿基組成上存在嚴重偏向的基因組區(qū)域仍是一大挑戰(zhàn)。在GEN雜志上,Patricia Fitzpatrick Dimond博士介紹了PCR-Free的基因組測序。
文庫制備的變革
2009年,Sanger研究院的Iwanka Kozarewa博士及其同事介紹了一種無需擴增的Illumina文庫制備方法(Nature Methods 2009;6:291–295)。他們表示,GC偏向的基因組的定位和組裝有所改善。這種方法采用簇擴增步驟來富集*連接的模板鏈,降低了重復序列的發(fā)生率,改善了序列定位和SNP檢出。
這種方法的核心是采用no-PCR接頭,它們包含額外的序列,讓模板能夠與流動槽表面直接雜交,這樣就不再需要PCR步驟。作者表示,通過此方法產生的DNA模板量低于PCR方法,但定量研究表明,從5 μg起始DNA中獲得的文庫足夠400個GA通道的測序,這滿足了大多數的實驗需求。此外,由于省去了PCR步驟,這種方法比標準的文庫制備更快。
Illumina的產品Rooz Golshani表示:“我們的PCR-free產品,TruSeq® DNA PCR-Free Library Preparation Kit,是金標準,也是產生zui完整基因組的*方案。”Golshani博士指出,研究人員在需要避免PCR相關的偏向時,往往采用此試劑盒來制備文庫。
2015年,J. Craig Venter研究所的Marcus B. Jones及其同事指出,隨著全基因組測序被廣泛用于人類微生物組研究,研究結果往往被證明是沖突或不確定的(Proc Natl Acad Sci USA 2015;10;112:14024-9)。
研究人員開展定量和定性分析來比較WGS宏基因組數據。他們采用Illumina Nextera XT和TruSeq DNA PCR-Free以及KAPA Biosystems的Hyper Prep PCR和PCR-Free系統(tǒng)。研究表明,這四種不同的NGS文庫制備導致分類出現(xiàn)明顯差異。根據分析的結果,他們建議從事微生物組研究的研究人員采用PCR-free的方法來減少PCR偏向,從而獲得更準確的分類信息。
納米孔測序
這些PCR-free的技術都是針對Illumina的測序儀開發(fā)的,不過,一種顛覆性的測序技術已經*改變DNA測序的方式,這就是納米孔測序。
Oxford Nanopore Technologies開發(fā)的手機大小的MinION測序儀有望zui終拋棄PCR。它讀取長的DNA片段,不過目前仍需要文庫制備。這種方法在分辨重復序列或單體型上具有優(yōu)勢,因為單個測序片段就能跨越含糊不清的區(qū)域。未來,這種設備有望用于實時醫(yī)療診斷和法醫(yī)檢驗。
不過,英國研究人員認為,在廣泛采用MinION之前,需要評估其通量和準確性(Biomol Detect Quantif 2015;3: 1–8)。他們利用MinION對三個細菌基因組進行重測序,這些有著不同的核苷酸組成。研究人員發(fā)現(xiàn),MinION堿基檢出后的錯誤率為38.2%。讀長平均值和中值分別為2 kb和1 kb,而zui長的序列達到98 kb。作者認為,盡管錯誤率限制了MinION的競爭能力,但是與Illumina MiSeq的數據相結合,MinION的序列數據可增強de novo組裝。
隨著MinION的試用報告不斷出爐,人們發(fā)現(xiàn),MinION本身也能做很多事情。它能可靠地測序小型基因組,如細菌和酵母。它也能區(qū)分親緣關系很近的細菌和病毒,讀取人類基因組中的復雜區(qū)域,并區(qū)分一對染色體上的兩個基因版本。此外,傳染病檢測也有望成為這種手持式測序儀的一大應用。
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