ELISA實(shí)驗(yàn)：在ELISA實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的抗原抗體反應(yīng)

1. 抗體的結(jié)構(gòu)

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)。Ig 分五類，即IgG、IgA 、IgM、IgD 和IgE。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig 主要為 IgG 和IgM。Ig 由兩個(gè)輕鏈(L)和兩個(gè)重鏈(H)的單體組成。Ig 的輕鏈?zhǔn)窍嗤?，?kappa;(kappa)和λ(Lambda )兩種型別。五類Ig 的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG 和IgM 的重鏈分別稱為γ(gamma )鏈和μ(mu )鏈。重鏈和輕鏈的 N 端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH 和VL 表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合，是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

IgG 可被木瓜蛋白酶分解為三個(gè)區(qū)段，其中兩個(gè)相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段(Fab )。每個(gè)Fab 都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價(jià)的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc 段，無(wú)抗體活性，但具有IgG *的抗原性。

IgG 可被胃蛋白酶分解為兩個(gè)片段，一個(gè)Fab 雙體，稱F(ab’)2，能和兩個(gè)相同的抗原結(jié)合;另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無(wú)生物活性。

IgM 是由五個(gè)單體組成的五聚體，含 10 個(gè)重鏈和10 個(gè)輕鏈，具有10 個(gè)抗原結(jié)合價(jià)，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià)。IgM 分子量約為900000， IgG 分子量約為150000 。

機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生 IgM 抗體，然后產(chǎn)生IgG 抗體。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，IgM 抗體量逐漸減少而消失，而IgG 抗體可長(zhǎng)期存在，在疾病*后可持續(xù)數(shù)年之久。IgM 抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性。因此IgM 抗體的測(cè)定，對(duì)某些傳染病如甲型肝炎有較高的研究診斷價(jià)值。右圖為為甲型肝炎病科研血清中IgG 抗體和IgM 抗體出現(xiàn)的時(shí)間和水平。

2. 抗原抗體反應(yīng)

2.1 可逆性

Ag·Ab 的解離程度與K 值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來(lái)提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG 抗體僅占總IgG 中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應(yīng)用于免疫測(cè)定中可得到更好的效果。

2.2 zui適比例

在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物(沉淀)的量見(jiàn)圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例zui合適的范圍，稱為等價(jià)帶(zone of equivalence )。在等價(jià)帶前后分別為抗體過(guò)剩帶和抗原過(guò)剩帶。

如果抗原或抗體極度過(guò)剩，則無(wú)沉淀物形成，在免疫測(cè)定中稱為帶現(xiàn)象(zone phenomenon )。抗體過(guò)量稱為前帶(prezone)，抗原地過(guò)量稱為后帶(postzone)。在用免疫學(xué)方法測(cè)定抗原時(shí)，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測(cè)得的量會(huì)小于實(shí)際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。

2.3 特異性

抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原( HBsAg )、e 抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg)，隨來(lái)源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物(例如血清)中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

但是這種特異性也不是的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜促性腺激素( hCG)和黃體生成激素(LH)均由α和β兩個(gè)亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG 免疫動(dòng)物所得的抗血清中含有抗α-hCG 和抗β-hCG 兩種抗體，抗α-hCG 抗體將與LH 中的α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在研究檢驗(yàn)中，如用抗hCG 抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG 濃度較高的試驗(yàn)，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH 將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷(敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG )的實(shí)際中必須應(yīng)用只對(duì)hCG 特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。

2.4 敏感性

在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為 mg/ml 水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫測(cè)定的敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml 水平。例如，用放射免疫測(cè)定法或酶免疫測(cè)定法測(cè)定HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng /ml。

3. 免疫測(cè)定在研究檢驗(yàn)中的應(yīng)用

由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣，在研究檢驗(yàn)中可用于測(cè)定：

1) 體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。

2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。

3) 抗生素和藥物。

4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg 等。

5) 另外，也可利用純化的抗原檢測(cè)標(biāo)本中的抗體，例如抗-HBs 等。

4.標(biāo)記的免疫測(cè)定

如上所述，免疫測(cè)定是一種很敏感的測(cè)定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測(cè)定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá) 5~10μg/ml，但在研究檢驗(yàn)中，某些待測(cè)物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測(cè)定是將檢測(cè)試劑中的抗原或抗體用可微量測(cè)定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記物來(lái)提高敏感度。在放射免疫測(cè)定和酶免疫測(cè)定中，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶，zui后用測(cè)定放射性和酶活力來(lái)計(jì)算待檢物的量，敏感度可比直接測(cè)定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測(cè)定中，一般加入過(guò)量的標(biāo)記試劑以保證與待測(cè)物*反應(yīng)。以標(biāo)記抗體(Ab ※)檢測(cè)抗原(Ag)為例，反應(yīng)式如下：

Ag+ Ab※→ AgAb※+ Ab※

在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag 結(jié)合的Ab※和游離和Ab※ ，如不將兩者分離而測(cè)定標(biāo)記物，測(cè)得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測(cè)定中的重要步驟。可采用多種手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過(guò)洗滌將游離的Ab ※除去，結(jié)合標(biāo)記物的測(cè)定可在固相上進(jìn)行。

5.酶免疫測(cè)定

酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay )可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous )兩種類型。

在均相EIA 中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測(cè)定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對(duì)底物作用的活力，因而測(cè)出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA 在研究檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。非均相EIA 需*行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971 年zui初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay )，簡(jiǎn)稱ELISA ，在國(guó)內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的，雖然含義不*確切，但已習(xí)用。

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