PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類信帆生物代做凝膠遷移電泳遷移率實驗(EMSA),咨詢!
一 探針的標記
1 如下設置探針標記的反應體系:
(1)待標記探針(1.75 pmol/微升):2微升。
(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X):1微升。
(3)Nuclease-Free Water:5微升。
(4)[γ-32P]atp(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml):1微升。
(5)T4 Polynucleotide Kinase(5-10 u/微升):1微升。
(6)總體積10微升。
(7)按照上述反應體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻。
2 使用水浴或PCR儀,37℃反應10分鐘。
3 加入1微升探針標記終止液,混勻,終止探針標記反應。
4 再加入89微升TE,混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見,通常不必測定探針的標記效率。
5 標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。
二 探針的純化
通常為實驗簡便起見,可以不必純化標記好的探針。在有些時候,純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化,可以按照如 下步驟操作:
1 對于100微升標記好的探針,加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無水乙醇,混勻。
2 在-70℃至-80℃沉淀1小時,或在-20℃沉淀過一夜。
3 在4℃,12 000 g-16 000 g離心30分鐘。小心去除上清,切不可觸及沉。
4 在4℃,12 000 g-16 000 g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀,但不宜過分干燥。
5 加入100微升TE,*溶解沉淀。標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。
三 EMSA 膠的配制
1 準備好倒膠的模具。可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具,或其它適當?shù)哪>摺_x擇可以灌制較薄膠的模具,以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果,可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。
2 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大)。
(1)TBE buffer(10X):1毫升。
重蒸水 16.2毫升。
(2)39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w):2毫升。
(3)80甘油:625微升。
(4)10% 過硫酸銨(ammonium persulfate):150微升。
(5)TEMED:10微升。
按照上述次序加入各個溶液,加入TEMED前先混勻,加入TEMED后立即混勻,并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡, 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡,可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理。
四 EMSA結(jié)合反應
1. 如下設置EMSA結(jié)合反應。
1.1 陰性對照反應:
(1)Nuclease-Free Water :7微升。
(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。
(3)細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子:0微升。
(4)標記好的探針:1微升。
(5)總體積:10微升。
1.2 樣品反應:
(1)Nuclease-Free Water :5微升。
(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。
(3)細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子:2微升。
(4)標記好的探針:1微升。
(5)總體積:10微升。
1.3 探針冷競爭反應:
(1)Nuclease-Free Water :4微升。
(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。
(3)細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子:2微升。
(4)未標記的探針:1微升。
(5)標記好的探針:1微升。
(6)總體積:10微升。
1.4 突變探針的冷競爭反應:
(1)Nuclease-Free Water :4微升。
(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。
(3)細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子:2微升。
(4)未標記的突變探針:1微升。
(5)標記好的探針:1微升。
(6)體積:10微升。
1.5 Super-shift反應:
(1)Nuclease-Free Water:4微升。
(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。
(3)細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子:2微升。
(4)目的蛋白特異抗體:1微升。
(5)標記好的探針:1微升。
(6)總體積 :10微升。
2 按照上述順序依次加入各種試劑,在加入標記好的探針前先混勻,并且室溫(20-25℃)放置10分鐘,從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合,或者讓冷探針優(yōu)先反應。然后加入標記好的探針,混勻,室溫(20-25℃)放置20分鐘。
3 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色,10X),混勻后立即上樣。注意:有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結(jié)合,建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣,可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液,至能觀察到藍顏色即可。
五 電泳分析
1 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色),以觀察電壓是否正常進行。
2 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍色),用于觀察電泳進行的情況。
3 按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃,如果溫度升高,需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處,停止電泳。
4 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注:通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板),把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘),輕輕揭起濾紙,這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。
5 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測,或用其它適當儀器設備檢測。
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