基本原理

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應的深淺來進行 定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

ELISA 可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有 3 種必要的試劑：

①固相的抗原或抗體

②酶標記的抗原或抗體

③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

注意事項

⒈正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA 等封閉。

⒉ 在 ELISA 中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：

⑴ 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當前常用的是 40孔聚苯乙烯 凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求 PH 在 9.0~9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也 有一定影響，一般多采用 4℃18~24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0 和 10 μg/ml 等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的 OD 值。選擇 OD 值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為 1~10 μg/ml.

⑶ 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接 ELISA 法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取「方陣法」（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。

⑷ 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如 OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條 件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如 TMB 和 ABTS是當前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間， 以 10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是 H2O2 在臨用前加入。