實時熒光定量PCR檢測服務(wù)所使用的熒光化學(xué)材料可分為兩大類,即熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR GreenⅠ為主要代表,是非特異性熒光化學(xué)材料。熒光探針包括TaqMan、分子信標(biāo)、熒光標(biāo)記引物、雜交探針等,屬于特異性熒光材料。

　　SYBR GreenⅠ是一種能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。在游離狀態(tài)下,SYBR GreenⅠ發(fā)出微弱的熒光,但是一旦與雙鏈DNA結(jié)合,其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。因此,一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)的雙鏈DNA量成正比,可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系中的雙鏈DNA的數(shù)量。其優(yōu)點是檢測方法簡單,通用性好,價格相對較低,是許多實驗室開展熒光定量實驗。SYBR GreenⅠ的缺點在于它能夠和所有的雙鏈DNA相結(jié)合,因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物引起的熒光信號會影響定量的準(zhǔn)確性。但可以通過優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件、選擇設(shè)計良好的引物,來減少或去除引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生;另外,也可以通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線進(jìn)行分析來判斷熒光信號的真實性。

　　TaqMan探針技術(shù)是有美國Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實時PCR定量技術(shù),在PCR擴(kuò)增加入一對引物的同時加入1個特異性的熒光探針,此熒光探針為一個30~45 bp的寡核苷酸,它設(shè)計為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對,其5′端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán),3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針保持完整時,3′端淬滅基團(tuán)抑制了5′端發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。但在PCR擴(kuò)增中,模板變性后低溫退火,引物與探針同時與模板結(jié)合,在引物的介導(dǎo)下,沿模板向前延伸至探針結(jié)合處,發(fā)生鏈的置換,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性將探針5′端連接的熒光發(fā)射基團(tuán)從探針上切割下來,游離于反應(yīng)體系中,從而脫離3'端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽,接受光刺激發(fā)出熒光信號。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是相對應(yīng)關(guān)系,且熒光強(qiáng)度同被釋放的熒光基團(tuán)的數(shù)目也是正比關(guān)系,因此該技術(shù)可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。TaqMan探針技術(shù)特異性好、準(zhǔn)確性高、假陽性低、重復(fù)性比較好。但是需要設(shè)計特異性的探針,因此成本較高。

　　分子信標(biāo)技術(shù)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)狀雙標(biāo)記寡核苷酸探針,環(huán)部與靶DNA序列互補,為15~35 bp;莖部是由互相配對的堿基組成,但與靶DNA無序列同源性,約8 bp。在探針的5′端和3′端分別標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)溶液中的模板與分子信標(biāo)結(jié)合配對時,分子信標(biāo)的構(gòu)象改變成鏈狀使得熒光發(fā)射基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開,當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時,就發(fā)出熒光信號。與探針互補的靶分子數(shù)量越多,熒光信號也就越強(qiáng),從而實現(xiàn)了對目的基因的定量檢測。分子信標(biāo)的方法優(yōu)點是特異性強(qiáng),熒光背景低。其缺點是設(shè)計困難,雜交探針不能*與模板結(jié)合,穩(wěn)定性較差,價格高。