選對凝膠很重要

3種zui常見的凝膠包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝膠的PH為8.6，且保質(zhì)期很短。在跑膠的過程中，PH還有上升的趨勢，可達(dá)到9.5。這會(huì)導(dǎo)致蛋白降解和低分辨率。

Bis-Tris凝膠的PH為6.4，相對Tris-Glycine凝膠，穩(wěn)定性和保質(zhì)期都有所增加。但這種凝膠需要在溶液中增加抗氧化劑，比如DTT，以維持蛋白的還原性。

Tris-Acetate 凝膠的PH為7，跑大分子蛋白會(huì)呈現(xiàn)很高的分辨率。 跑大分子蛋白時(shí)，我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠。

凝膠濃度很重要

既然選擇了Tris-Acetate 凝膠，還有幾個(gè)要考慮的問題。凝膠濃度與孔徑成反比：濃度越小，孔越大。較大的蛋白質(zhì)更容易通過較大的孔，所以我建議使用低百分比的凝膠，如7％。可以使用梯度凝膠或非梯度凝膠，梯度凝膠非常適合新樣本。

提高轉(zhuǎn)移buffer中的SDS，減少甲醇

轉(zhuǎn)移buffer的組成至關(guān)重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。通過減少轉(zhuǎn)移buffer中的甲醇百分比（10％或更低）來避免這種情況發(fā)生。 為了進(jìn)一步確保蛋白質(zhì)不會(huì)沉淀，考慮添加SDS至終濃度為0.1％。SDS向蛋白添加均勻的負(fù)電荷，使得它們更容易從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。

選擇合適的膜

膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白選擇PVDF膜。如前面所說，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在轉(zhuǎn)移buffer中添加甲醇，目的蛋白轉(zhuǎn)印的機(jī)會(huì)更高。兩種類型的膜都有各種孔徑尺寸，zui常見的是0.2um和0.45um。與凝膠一樣，較大的蛋白比較小的更容易穿過大孔隙。大多數(shù)蛋白質(zhì)（> 20kDa）可以用0.45um膜轉(zhuǎn)移，避免使用0.2um孔徑。

增加轉(zhuǎn)印時(shí)間

在正確的選擇完凝膠、轉(zhuǎn)印膜及轉(zhuǎn)移buffer后，轉(zhuǎn)印正式開始。半干轉(zhuǎn)快且方便，但不適用于大分子蛋白。我建議濕轉(zhuǎn)，因?yàn)榇蠓肿拥鞍邹D(zhuǎn)移時(shí)間很慢，推薦350-400 mA轉(zhuǎn)移90min或 4°C，40 mA，轉(zhuǎn)印留夜。

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